一、elisa實(shí)驗(yàn)步驟介紹

　　樣品收集、處理方法

　　1、血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，室溫血液自然凝固10-20分鐘，2000-3000rpm離心20分鐘，將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離，收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

　　2、血漿：根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑?；旌?0-20分鐘后，2000-3000rpm離心20分鐘。收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

　　3、細(xì)胞上清液：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。2000-3000rpm離心20分鐘，收集上清。

　　4、組織勻漿：標(biāo)本采集后用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。使用時(shí)取適量標(biāo)本，加入一定量的PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分后，2000-3000rpm離心20分鐘，收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

二、樣品保存

　　如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

　　實(shí)驗(yàn)步驟

　　1、從室溫平衡20分鐘后的鋁箔袋中取出所需酶標(biāo)板孔數(shù)目，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

　　2、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL，空白孔不加。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

　　3、加酶：標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔。

　　4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60分鐘。

　　5、配液：將20X濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后備用。

　　6、洗滌：小心揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

　　[洗板方法]

　　手工洗板：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上拍干，反復(fù)5次。

　　自動(dòng)洗板：每孔注入洗液350μL，浸泡1分鐘，洗板5次。

　　7、顯色：每孔加入底物A、B各50μL，輕輕震蕩混勻后，37℃避光孵育15min。

　　8、終止：每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立刻轉(zhuǎn)為黃色。

　　9、測(cè)定：以空白孔調(diào)零，15分鐘內(nèi)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。

三、elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

　　繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度?；蛴脴?biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

四、elisa實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)

　　1、試劑盒保存在2–8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，屬于正常現(xiàn)象，可水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

　　2、要嚴(yán)格避免操作過(guò)程中酶標(biāo)板干燥，干燥會(huì)使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活。

　　3、禁止混用不同批次試劑盒內(nèi)的試劑。

　　4、本公司提供的96孔酶標(biāo)板是單條可拆型酶標(biāo)板，用戶可按需求使用;剩余的酶標(biāo)板請(qǐng)放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

　　5、請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。