克隆感受態(tài)細(xì)胞主要采用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，吸收周圍環(huán)境中的DNA分子，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。它的主要原理就是通過處理使細(xì)胞的通透性變大，直觀的說，使得細(xì)胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞，便于外源基因或載體進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。由于細(xì)胞膜的流動(dòng)性，這種孔洞會(huì)被細(xì)胞自身所修復(fù)。

 

　　克隆感受態(tài)細(xì)胞操作方法：

　　1、DH5α感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物）并用手bo打EP管底輕輕混勻（避免用槍吸打），冰中靜置25分鐘；

　　2、42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率；

　　3、向離心管中加入700 μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基（2YT或LB），混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘；

　　4、5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上；

　　5、將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。如果進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作，將平板放37℃培養(yǎng)至少15小時(shí)。

 

　　注意事項(xiàng)：

　　1、感受態(tài)細(xì)胞在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過長，長時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率；

　　2、混入質(zhì)粒或連接產(chǎn)物時(shí)應(yīng)輕柔操作；

　　3、轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。